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La PCR è un test che è stato utilizzato nella diagnosi di molte malattie. Il metodo PCR permette di mostrare la presenza diretta di batteri nell'organismo, e nello specifico nel suo DNA. Viene utilizzato il test PCR, tra gli altri nella diagnosi della malattia di Lyme. Qual è la tecnica PCR? Cos'è la PCR in tempo reale?
Sommario:
- PCR (test) - qual è la tecnica PCR?
- PCR (ricerca) - applicazione del metodo PCR
- PCR (ricerca) - Malattia di Lyme
- PCR (ricerca) - risultati. Possono essere falsi positivi?
- PCR (ricerca) - risultati. Possono essere falsi negativi
La PCR (reazione a catena della polimerasi) è il metodo di base utilizzato nei laboratori genetici e molecolari. È stato sviluppato nel 1983 da Kara Mullis, che ha ricevuto il Premio Nobel nel 1993 per questo.
Ascolta in cosa consiste la tecnica PCR. Questo è materiale dal ciclo ASCOLTARE BENE. Podcast con suggerimenti.
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PCR (test) - qual è la tecnica PCR?
Il test PCR consiste nell'amplificazione multipla (solitamente 30-40 cicli) di uno specifico frammento di DNA, ad es. Geni che codificano per le proteine Borrelia, con l'uso dell'enzima polimerasi.
Quindi, speciali coloranti molecolari vengono utilizzati per rendere visibile il frammento di DNA amplificato. La PCR, grazie all'amplificazione di specifici frammenti di DNA, è un metodo ultra sensibile.
Nel metodo PCR, i frammenti di DNA vengono amplificati con coppie di primer specifiche per una data regione del DNA batterico. Ad esempio, le regioni bersaglio nella PCR utilizzate nella diagnosi della malattia di Lyme sono geni che codificano per proteine, ad es. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.
Il materiale biologico da cui è possibile eseguire il test è:
- sangue
- una sezione di pelle da un eritema migrante
- liquido cerebrospinale
- liquido sinoviale o dalla cartilagine articolare
- urina
PCR (ricerca) - applicazione del metodo PCR
Oltre alla diagnosi di borreliosi di Lyme mediante il metodo PCR, è possibile rilevare specifici frammenti di DNA di altri microrganismi o umani. Pertanto, il metodo PCR viene utilizzato anche in:
- diagnostica e monitoraggio delle infezioni virali: virus dell'herpes (herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, citomegalovirus), HIV, virus dell'epatite (HBV e HCV)
- diagnostica e monitoraggio delle infezioni batteriche, in particolare di quei batteri che non possono essere identificati attraverso la coltura, ad esempio la tubercolosi
- diagnostica e monitoraggio delle malattie neoplastiche: leucemia, cancro al seno, cancro colorettale, cancro ai polmoni
- diagnosi di predisposizione al cancro: cancro al seno e alle ovaie (geni BRCA1 e BRCA2), cancro del colon-retto (geni APC e CHEK2)
- diagnostica delle malattie genetiche: emocromatosi (gene HFE), talassemia (geni HBA1 e HBA2), malattia celiaca (geni HLA)
- test di paternità, che rilevano la compatibilità del DNA del bambino e del padre
Attualmente, ci sono molte modifiche al metodo PCR. Ad esempio, nella diagnosi della borreliosi di Lyme, vengono utilizzati principalmente i metodi di PCR annidata e PCR in tempo reale. Quest'ultimo è un metodo quantitativo e consente la determinazione del numero esatto di copie di Borrelia DNA nel materiale biologico testato.
PCR (ricerca) e malattia di Lyme
I test sierologici sono la base per la diagnosi della malattia di Lyme. Tuttavia, ci sono situazioni cliniche che possono causare un falso negativo di questi test:
- finestra sierologica, ovvero il periodo iniziale di infezione in cui l'organismo non produce ancora anticorpi IgM e IgG specifici contro Borrelia spirochete
- nelle persone con immunodeficienza che non producono abbastanza anticorpi
- la presenza di immunocomplessi costituiti da antigeni Borrelia spirochete e da anticorpi specifici per essi e prevengono la rilevazione di anticorpi con metodi sierologici
Se nel paziente si sospettano i sintomi della malattia di Lyme ei risultati del test sierologico sono negativi, è possibile eseguire il test molecolare basato sul metodo PCR.
Il DNA delle spirochete di Borrelia può essere rilevato nella fase iniziale dell'infezione, perché il numero di spirochete nei fluidi corporei è quindi il più alto.
Nella diagnosi della borreliosi di Lyme vengono utilizzati principalmente metodi sierologici come l'ELISA, ma in alcune situazioni cliniche sono utili i test genetici che utilizzano il metodo PCR.
Più lungo è il tempo dall'infezione, meno è probabile che rilevi il DNA batterico. Pertanto, in alcuni casi, prima di eseguire il test PCR, i batteri vengono coltivati su terreni speciali per 1-2 settimane e quindi viene eseguito il test.
Questo approccio viene utilizzato in caso di sospetto di malattia di Lyme e liquido cerebrospinale raccolto. Nella fase avanzata dell'infezione, è più appropriato eseguire un test ELISA.
Il metodo PCR non deve essere utilizzato nella diagnosi di routine della borreliosi di Lyme a causa della mancanza di standardizzazione per quanto riguarda la presenza delle varietà Borrelia burgdorferi in Polonia.
Tuttavia, in caso di difficoltà nella diagnosi (soprattutto nella fase iniziale della malattia), il risultato del test PCR aiuta nel processo diagnostico.
Un risultato positivo del test significa che la presenza di Borrelia burgdorferi DNA e delle sue varietà è stata rilevata nel materiale testato, ma non spiega se è in corso un'infezione attiva nel corpo. D'altra parte, un risultato negativo non esclude la presenza di batteri nel corpo.
Alcuni laboratori offrono test per la presenza di DNA di Borrelia nella zecca. Tuttavia, il risultato di tale esame non è la base per la diagnosi della malattia di Lyme in una persona morsa.
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La PCR è un metodo ultrasensibile e, allo stesso tempo, molto sensibile alla contaminazione. Pertanto, è molto importante nei test basati sulla PCR selezionare un controllo interno appropriato per escludere falsi positivi.
La chiave è anche la corretta raccolta del materiale per i test, nonché l'esperienza e l'affidabilità del diagnostico che esegue il test.
PCR - risultati. Possono essere falsi negativi
Come in ogni test di laboratorio, anche nel metodo PCR possono comparire risultati falsi negativi. Qui è fondamentale raccogliere il sangue per un anticoagulante appropriato, perché alcuni di essi, come l'eparina, possono inibire la reazione PCR.
Inoltre, la raccolta di materiale dopo l'inizio della terapia antibiotica può causare una diminuzione dell'efficienza della reazione PCR e una maggiore probabilità di risultati falsi negativi.
Va inoltre ricordato che i batteri Borrelia vivono per brevissimo tempo nel sangue e nei fluidi corporei, perché grazie a speciali recettori penetrano molto rapidamente in punti "difficili da raggiungere" del corpo.
Pertanto, in contrasto con la diagnostica di altri microrganismi, il numero di spirochete di Borrelia nel materiale biologico è piccolo, a volte anche al limite di rilevamento del metodo PCR. Ciò può anche causare un falso negativo.
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- Dunaj J. et al ... L'importanza del metodo PCR nella diagnosi della borreliosi di Lyme. Navigare Epidemiol. 2013, 67, 119-123.
- Diagnostica di laboratorio delle malattie trasmesse dalle zecche Raccomandazioni del gruppo di lavoro: Camera nazionale dei diagnostici di laboratorio, Istituto nazionale di sanità pubblica-Istituto nazionale di igiene, Consulente nazionale nel campo delle malattie infettive, Dipartimento di malattie infettive e neuroinfezioni, Università di medicina di Białystok, Società polacca di virologia, Varsavia 2014.
- Ružić-Sabljić E. e Cerar T. Progressi nella diagnosi molecolare della malattia di Lyme. Esperto Rev Mol Diagn. 2017 gennaio; 17 (1): 19-30.
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